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液相方法開(kāi)發(fā)攻略 - 彈：實(shí)現保留
液相方法開(kāi)發(fā)攻略
彈：實(shí)現保留
今天要為大家帶來(lái)一個(gè)新干貨系列——液相方法開(kāi)發(fā)攻略！
在進(jìn)行液相色譜分析時(shí)，我們通常有以下訴求：
而在液相分析工作中，液相方法的開(kāi)發(fā)一直是一項比較具有難度的工作，不論是新手小白，還是有經(jīng)驗的實(shí)驗室老師，在面對新項目的方法開(kāi)發(fā)時(shí)，總會(huì )遇到一些問(wèn)題。
因此，YoYo特意把大曹三耀技術(shù)中心多年來(lái)積累總結的經(jīng)驗，梳理匯總為這一系列液相方法開(kāi)發(fā)攻略，并將圍繞以下四個(gè)方面展開(kāi)介紹：
★ 實(shí)現保留
★ 實(shí)現分離
★ 峰形和理論塔板數
★ 壽命
今天先來(lái)介紹重要也是關(guān)鍵的彈——實(shí)現保留，后續幾篇將在今后陸續推送，敬請期待喲~
由于大部分化合物都可以在反相分析模式下，使用反相C18色譜柱進(jìn)行分析與保留，因此，在建立新方法時(shí)，反相C18色譜柱也是優(yōu)先選擇的色譜柱。一般可以按照以下步驟進(jìn)行調整：
反相C18柱初篩 看是否有保留
提問(wèn)：方法初篩時(shí)，選擇什么樣的C18色譜柱比較好？
YoYo老師：選擇一款普適型色譜柱，要求硅膠純度高、金屬雜質(zhì)低、具有適中的疏水性與表面極性，能分析大多數常規化合物，峰形好、壽命長(cháng)，分離度高，柱效高~
這些要求很過(guò)分嗎？不！
這是我們對CAPCELL PAK C18 MGII色譜柱的基本要求！
CAPCELL PAK C18 MGII
CAPCELL PAK C18 MG系列色譜柱憑借填料表面致密的聚合物包被技術(shù)，極大程度地抑制了硅膠基材的金屬雜質(zhì)及殘留硅醇基等不良影響，CAPCELL PAK系列色譜柱具有以下特長(cháng)：
★ 極大限度地減少配位化合物的吸附
★ 極大限度地抑制殘留硅醇基的二次效應
★ *的耐酸、耐堿性能
★ 能得到對稱(chēng)性良好的色譜峰
★ 具備良好的保留與分離能力
其中，CAPCELL PAK C18 MGII色譜柱是普適性很強的C18色譜柱，可以滿(mǎn)足大部分化合物的分析需求。
那么，在經(jīng)過(guò)C18色譜柱初篩之后，還是發(fā)生了保留不充分的情況，應該如何調整分析方法來(lái)實(shí)現保留呢？
1
調整pH值
在反相模式下，對于不同性質(zhì)的化合物也應采取不同的流動(dòng)相條件及相應色譜柱。例如，酸性化合物在酸性條件下保留較強，堿性化合物在堿性條件下保留較強，利用這一性質(zhì)，調整適合的pH值，并選擇相應適合的色譜柱，即可達到良好保留結果。
在設定流動(dòng)相pH時(shí)需要注意：離子性化合物可能會(huì )由于流動(dòng)相pH值設定的不合理而發(fā)生漂移，建議將流動(dòng)相的pH值設定在化合物的pKa±2以上范圍。
2
更換保留模式
如果調整流動(dòng)相pH也不能解決保留問(wèn)題，該化合物可能不適合在反相模式下進(jìn)行保留和分析，這時(shí)，可以考慮更換保留模式進(jìn)行進(jìn)一步的方法摸索。
★ 離子交換模式（離子對試劑、離子交換柱）
★ HILIC模式
★ 正相模式
色譜柱的選擇
對于強極性、小分子類(lèi)化合物，可以使用高極性反相柱或在HILIC模式下進(jìn)行保留嘗試
★ 高極性反相柱：AQ、ADME
★ HILIC（親水性相互作用）柱：PC HILIC、NH2、SILICA
對于酸性化合物，可以使用陰離子交換柱或反相柱+正離子對試劑的方法，使酸性化合物處于分子態(tài)，利于增強保留
★ 陰離子交換柱：NH2
★ 反相柱+正離子對試劑：C18 MG、C18 MGII、SPOLAR C18
對于堿性化合物和兩性化合物，可以嘗試使用陽(yáng)離子交換柱或反相柱+負離子對試劑的方法，使堿性化合物處于分子態(tài)，增強保留
★ 陽(yáng)離子交換柱：SCX、CR
★ 反相柱+負離子對試劑：C18 MG、C18 MGII、SPOLAR C18
分離模式選擇例
接下來(lái)，YoYo將以三聚氰胺的分析為例，對保留困難的化合物的方法建立進(jìn)行說(shuō)明。
三聚氰胺俗稱(chēng)蜜胺、蛋白精，是一種三嗪類(lèi)含氮雜環(huán)有機化合物，為重要的氮雜環(huán)有機化工原料，有毒，不可用作食品加工和食品添加劑，pKa=8，屬于弱堿性化合物。
三聚氰胺
Melamine
M.W. :126.12
（一）離子交換模式
在離子交換模式下進(jìn)行分析，能對三聚氰胺得到良好保留。具體做法可分為以下兩種：
1. 反相色譜柱 + 離子對試劑
▲CAPCELL PAK C18 MG+離子對試劑
HPLC Conditions (Refer to GB/T 22388-2008):
Column: CAPCELL PAK C18 MG S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm
M.Phase: 10 mM citric acid, 10mM SOS (pH 3.0 adjusted with NaOH) / CH3CN = 90 / 10
Flow rate: 1 mL/min
Oven Temp.: 40°C
Detector: UV 240 nm
Sample: Melamine in M.P.
Inj. Vol.: 20 μL
2. 離子交換色譜柱分析
▲CAPCELL PAK SCX色譜柱
HPLC Conditions:
Column: CAPCELL PAK SCX UG80 S5; 4.6 mm i.d. × 150 mm
M.Phase: 50 mM KH2PO4 (pH 3.0 adjusted with H3PO4) / CH3CN = 70 / 30
Flow rate: 1 mL/min
Oven Temp.: 30°C
Detector: UV 240 nm
Sample: Melamine in M.P.
Inj. Vol.: 20 μL
CAPCELL PAK SCX
CAPCELL PAK SCX是一款解決了傳統硅膠系離子交換柱存在的問(wèn)題的聚合物包被型強陽(yáng)離子交換色譜柱。在精密分級的5 μm的高純度硅膠上形成高分子聚合物包被后，導入磺酸基。聚合物包被型的Si-C結合比一般的化學(xué)結合型硅膠系SCX的Si-O-Si結合更穩定，耐久性更強。
★ 通過(guò)強陽(yáng)離子交換作用和疏水性相互作用的共同保留機制來(lái)進(jìn)行保留
★ 批次間重現性良好
★ 耐久性強
不論是反相柱+離子對試劑，還是使用離子交換色譜柱進(jìn)行分析，都會(huì )發(fā)現色譜柱平衡時(shí)間對保留時(shí)間的影響。在離子交換模式下進(jìn)行分析時(shí)，需要充分平衡色譜柱，建議小流速過(guò)夜平衡，可以得到比較穩定的實(shí)驗結果。
（二）高極性反相色譜柱
鍵合金剛烷基團的CAPCELL PAK ADME色譜柱，兼具高表面極性和一定的疏水性，不僅適用于強極性物質(zhì)的保留，也適用于強極性物質(zhì)和疏水性物質(zhì)的多組分共同分析。
使用鍵合*金剛烷基團的CAPCELL PAK ADME色譜柱，在簡(jiǎn)單的2%甲醇條件下即可實(shí)現三聚氰胺和雙氰胺的良好保留與分離。這得益于A(yíng)DME色譜柱*的表面極性與保留模式。
▲CAPCELL PAK ADME分析三聚氰胺與雙氰胺結果
*峰1：雙氰胺，峰2：三聚氰胺
HPLC Conditions:
色譜柱：CAPCELL PAK ADME S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm
流動(dòng)相：2% CH3OH
流 速：1000µL / min
溫 度：35°C
檢 測：PDA210 nm
進(jìn)樣量：5 µL
樣 品：10 μg/mL（流動(dòng)相溶解稀釋?zhuān)?/p>
CAPCELL PAK ADME
CAPCELL PAK ADME色譜柱采用*的立體籠狀金剛烷基官能團——ADME官能團，突破了以C18官能團為主的傳統柱在反相保留機理中的可分析化合物的限制，使可分析化合物的極性范圍得到了巨大的提升；并且，在極性提升的同時(shí)還兼顧一定的疏水性；從而，包含從強極性化合物到疏水性化合物的復雜組分樣品在A(yíng)DME上也能同時(shí)得到良好的保留。
★ 立體籠狀金剛烷基官能團——*的*的表面極性與疏水性平衡
★ 高表面極性——對強極性化合物的良好保留
★ 兼顧一定疏水性——從極性到疏水性化合物的共同分析
★ 立體選擇性——空間異構體拆分能力
ADME(adamantane)金剛烷，我們將這種籠狀結構的金剛烷基團以控制的鍵合密度導入填料表面，通過(guò)“新型官能團”和*的包被型填料表面“控制技術(shù)”，我們將保持疏水性又提高表面極性變?yōu)榭赡?；由于金剛?的籠狀結構所帶來(lái)的立體選擇性，還賦予了ADME分離結構類(lèi)似化合物的能力。
（三）親水性相互作用 HILIC模式
親水性相互作用色譜法（HILIC）是針對在常規C18色譜柱上保留較弱的強親水性物質(zhì)的保留方法。在HILIC模式下，通過(guò)鍵合極性官能團的固定相與反相模式常用的CH3CN / H2O系流動(dòng)相條件相組合，對親水性化合物進(jìn)行保留與分離。因此，HILIC是在HPLC的分離模式中常使用的反相模式的反相，故也被稱(chēng)為“反反相模式”。
大阪曹達獨立研發(fā)合成了構成細胞膜的主要磷脂類(lèi)物質(zhì)之一的卵磷脂親水性部位——PC基團（磷酸膽堿基團），作為PC HILIC色譜柱的官能團，對親水性化合物的保留具有優(yōu)勢。
如下圖，使用PC HILIC色譜柱和另一款其他品牌色譜柱Column B進(jìn)行對比，對三聚氰胺進(jìn)行分析，在10 mmol/L HCOONH4, CH3CN / H2O = 90 / 10（pH = 3.0）條件下，PC HILIC色譜柱所得保留時(shí)間更長(cháng)，理論塔板數更高，即使是在水相比例為20%時(shí)，也得到了足夠的保留。
▲PC HILIC色譜柱在不同條件下分析結果
HPLC Conditions：
Column : PC HILIC 4.6 mm i.d. x 250 mm
Mobile phase : 10 mmol/L HCOONH4, CH3CN / H2O = 90 / 10, pH = 3.0
Flow rate : 1.0 mL/min
Temperature : 40 ?C
Detection : UV 235 nm
Inj. vol. : 10 μL
Sample dissolved in: Mobile phase
PC HILIC
大阪曹達獨立研發(fā)合成了構成細胞膜的主要磷脂類(lèi)物質(zhì)之一的卵磷脂親水性部位——PC基團（磷酸膽堿基團），作為PC HILIC色譜柱的官能團，對親水性化合物的保留具有優(yōu)勢。
★使用超親水性的磷酸膽堿基團作為官能團的HILIC色譜柱
★隨乙腈含量增加，保留增大，通常70%乙腈
（四）LC-MS分析——混合模式保留
MS檢測對流動(dòng)相的要求：
★ 不含離子對試劑
★ 揮發(fā)性鹽，低濃度
陽(yáng)離子交換填料柱 + 揮發(fā)性鹽溶液（低濃度）
SCX + C18 = CR ！
在以MS檢測器進(jìn)行分析時(shí)，流動(dòng)相條件會(huì )對靈敏度產(chǎn)生很大影響，CAPCELL PAK CR色譜柱混合了C18和強陽(yáng)離子交換SCX填料，即使對多種堿性化合物進(jìn)行同時(shí)分析，也能兼顧對保留和MS檢測靈敏度的要求。
如上圖，在中性條件下：
● C18色譜柱：中性化合物得到保留，酸性、堿性化合物快速出峰；
● SCX色譜柱：堿性化合物得到保留，中性、酸性化合物快速出峰；
● 混合了兩種填料的CR色譜柱：堿性化合物得到保留，中性化合物能得到適度保留，酸性化合物依然快速出峰。
此時(shí)，只需將流動(dòng)相條件調整為酸性，即可在CR色譜柱上同時(shí)保留這三種類(lèi)型的化合物：
HPLC Conditions：
Column ：CAPCELL PAK CR S5 1:4 ; 2.0 mm i.d. × 150 mm
Mobile Phase：1.0 vol% CH3COOH,
25 mmol/L CH3COONH4 / CH3CN = 50 / 50
Flow rate ：200 µL/min
Temp ：40 ℃
Detection ：UV 240 nm
Injection ：2 µL
Sample ：10 µg/mL
CAPCELL PAK CR
CAPCELL PAK CR色譜柱是一款混合C18和強陽(yáng)離子交換SCX填料的色譜柱。對多種堿性化合物進(jìn)行同時(shí)分析時(shí)，能同時(shí)兼顧對保留和MS檢測靈敏度的要求。
★ 強陽(yáng)離子交換SCX與C18混合填料
★ 具有*分離模式
★ 適合于LC-MS的高靈敏度離子化合物分析
★ 可對酸性、中性、堿性化合物進(jìn)行同時(shí)保留
★ 有3種混合比例可供選擇
*與武田制藥共同開(kāi)發(fā)
通過(guò)調整流動(dòng)相的鹽濃度，可在離子交換作用下針對堿性化合物的保留程度進(jìn)行調整，從而改變分離模式，達到不同極性化合物同時(shí)分析的效果。
